Ⅰ.目的
本實驗的設計在於利用重組質體DNA來表現或生產蛋白質，除了前述的實驗來生產半乳糖苷酶之外，在此可熟悉基因表現的調控機制，與重組螢光蛋白質的操作經驗。
生物冷光（bioluminescence）是在大自然中生物所發出的光之總稱，這些會發光的生物包括細菌、螢火蟲、昆蟲、水生藻類及動物等。這些光的產生可直接以肉眼關查獲利用儀器做科學化的判讀及計量，因此生物冷光變成為現今分子生物學家所常應用的系統與研究的目標。並非所有可發光的生物體都可被利用，目前已被選殖出並應用於基因表現及報告者，只有細菌、螢火蟲及水母的冷光基因，細菌的冷光（bacterial luciferase）是dimer型態（80 KDa）來自於數種水生細菌及一種陸生細菌，其發光機制是一種自發性（autonomous）表現，不需外加受質（如luciferin），缺點是不適合在真核宿主中表現，因需lux operon表現，故不適合做報告者基因，靈敏度（sensitivity）及使用方便性較差。螢火蟲的冷光（firefly luciferase）為monomer（61 KDa）來自於螢火蟲，具催化分解受質（luciferin）的能力，此系統可有效的偵測到細胞內報告者基因表現，靈敏度極高，缺點是發光時間短，可在反應中加入coenzyme A以減緩冷光衰退。水母的冷光（Renilla luciferase）亦為monomer（31 KDa）來自水母（Renilla reniformis）是一種腔腸動物（chelenterate），水母受外界觸碰刺激，便會藉由發光來嚇走或驅退侵略者，以維護自身安全，缺點是會有一些低量的非酵素螢光產生而減弱分析能力，故一般在應用上被當作輔助報告者基因。另外一種水母冷光Aequoria又稱為GFP（green fluorescence protein）在Ca2+存在下，可持續的發光，本身不具催化分解受質的能力，故Renilla luciferase與GFP之構造與發光機制是截然不同。
螢光蛋白質（green fluorescence protein）具有238個胺基酸，分子量約為26,888 Da，在1992年由華盛頓州星期五港口（Friday Harbor）的水母（jellyfish, Aequorea victoria）身上得到其基因，此GFP的最大特點是在於本身散發的綠色螢光，不需其他因子或受質來參與或催化，而且對於細胞無害，故自1994以來已經廣泛地在各種領域被應用，成為一個極佳的報告者（reporter）。本實驗所用重組質體DNA有兩種選擇，一為pGLO（Bio-Rad），GFP基因的表現受阿拉伯膠糖起動子（araBAD）所控制，故加入阿拉伯膠糖（arabinose）達最終濃度為0.2%可誘導GFP蛋白質大量表現。因GFP蛋白質有較高的厭水性（hydrophobicity），繼之，利用厭水交互層析法（hydrophobic interaction chromatography, HIC）來進行蛋白質純化。另一為pQE-GFP重組質體DNA，在T5 promoter/lac operator element之後接著有6xHis-tagged GFP，基因的表現受IPTG所誘導，所生產的GFP蛋白質具有His-tag，因此可以親和層析法（His-Bind column chromatography）來純化GFP蛋白質（參考實驗17）。
II.GFP之抽取
1.儀器用具：
同實驗15
2.藥品及試劑：
a. LB broth
b. ampicillin（100mg/ml）
c. 20% arabinose（以0.44mm膜過濾）
d. extraction buffer：0.1 M sodium phosphate（Na2HPO4）, pH 7.0, 1 M NaCl, 8 M urea
3.方法步驟：
１）于實驗前一天，助教會將轉形細胞株pGLO〔DH5α〕接種於2 ml LB＋ampicillin，並在37 ℃振盪培養過夜。
２）早上8點時，將100 ml轉形細胞株過夜菌液加入10 ml LB＋ampicillin，置於37 ℃振盪培養2小時。
３）早上10點時，加入100 ml 20% arabinose於培養菌液中，置於37 ℃振盪培養4小時。
４）在4 ℃下，以8,000 rpm離心5分鐘，倒掉上清液，加入1 ml extraction buffer懸浮菌液，置於冰浴中，以超音波破碎機將菌體打破。
５）轉至1.5 ml離心管，在4 ℃下，以12,000 rpm離心10分鐘，收集上清液至乾淨的離心管。
III.GFP之純化
1.儀器用具：
a. 管柱（column, 1 ´ 10 cm, 可容納5 ml）
b. 分段收集器（fraction collector）
c. UV monitor 或spectrophotometer
2.藥品及試劑：
a. extraction buffer：0.1 M Na2PO4, pH 7.0, 1 M NaCl
b. elution buffer：0.1 M Na2PO4, pH 7.0, 8 M urea
c. Macro-Prep methyl HIC support（Bio-Rad）
3.方法步驟：
１）將2 ml HIC beads懸浮於管柱中，加入水做packing column。
２）加入水清洗管柱，共4ml。
３）加入4ml extraction buffer做equilibrium。
４）加入GFP抽取物，待溶液全沒入bead bed內，加入4 ml elution buffer並收集流出物。（註：GFP呈黃綠色 ，肉眼可觀察其移動的位置，必要時可在UV燈下觀察）。
５）利用UV spectrophotometer讀取各收集管之OD280值，並畫出沖離液之曲線圖（參考實驗17）。
６）GFP蛋白質可進一步做電泳分析（參考實驗16）。
