實驗13　北方墨漬法

Ⅰ.目的

　　基因表現的第一步是由DNA-dependent RNA polymerase行轉錄反應（transcription）以DNA為模板合成出mRNA。由於mRNA是細胞內不同基因之轉錄產物，其序列與大小不一，存在量也受嚴格調控，一般約佔細胞內total RNA的1~5%。其餘RNA（80~85%）分屬於rRNA、tRNA、snRNA（small nuclear RNA）與scRNA（small cytoplasmic RNA）等，它們分別以RNA的型式直接參與細胞內特定功能之執行，包括mRNA剪輯（splicing）與蛋白質的轉譯（translation）等。因為轉錄反應是基因表現的重要調控點，在分析特定基因之表現情形時，勢必得先瞭解mRNA的基本性質，包括長度及表現量的多寡等。本實驗所要進行北方墨漬法（Northern blotting）加上實驗9所介紹雜合反應，整體形成北方雜合分析（Northern hybridization analysis）是一般用來分析mRNA最常見的方法之一。在進行北方雜合分析時，首先必須製備RNA，然後進行變性洋菜膠電泳分析，再以毛細管轉移法或其他方法轉漬於尼龍膜（nylon membrane）上，最後以特定核酸探針進行雜合分析，即可偵測出目標mRNA的長度及存在量。

II.RNA來源

1.由大腸桿菌pT7-lacZ〔BL21(DE3)〕抽取RNA（參見實驗11）。

2.由pT7-lacZ質體DNA做胞外轉錄反應（參見實驗12）。

III.探針之製備

1.由lac-Z基因片段做DIG random priming（參見實驗9）。

IV.變性洋菜膠電泳

1.RNA是細胞轉錄反應的產物，雖然一般RNA是單股polynucleotides，但會纏繞成特定的二度或三度結構，與特定的蛋白質結合成ribonucleoprotein particles（RNPs）的型式存在於細胞內。由於核酸構形（conformation）與大小會影響核酸在電泳分析時的泳動速率，故一般以電泳分析RNA時，都採用變性膠體電泳。在進行這類電泳分析時，RNA已被denatured，影響其泳動速率的因子主要是長度，一旦RNA以變性膠體解析好，即可進一步進行北方轉漬與雜合分析。

2.在進行RNA變性膠體電泳時，如所要分析的RNA比較小（<1 Kb），可以選用聚丙醯胺膠體，所用之變性劑（denaturing reagent）主要是尿素（urea），此法一般也被用來分析核酸定序（sequencing）反應。

3.一般採用的主要變性膠體電泳分析之變性劑包括glyoxal/dimethyl sulfoxide（DMSO）與甲醛（formaldehyde）兩種。前者glyoxal/DMSO系統進行電泳分析時，其缺點在於導致電泳槽兩邊的pH落差甚大，會影響電泳的進行，解決之道是在兩極間加裝循環裝置，泳動速率也儘量放慢。後者使用甲醛系統，其缺點在於甲醛氣體為有毒物質，配製甲醛洋菜膠及進行電泳分析時，均應在抽氣櫃中操作。

4.如前述，能否將RNase去除乾淨是RNA相關實驗成功與否的主要決定因子。在進行RNA電泳分析時，為了避免RNase可能帶來的問題，實驗室內最好準備一套電泳器材專供RNA分析之用。若所使用的迷你電泳槽及鑄膠器平常也用來做DNA分析的話，在進行RNA變性膠體電泳分析前，應仔細的加以清理，清理時除了以中性清潔劑徹底沖洗乾淨外，最好再用3%過氧化氫（H₂O₂）浸泡10分鐘。

5.儀器用具：

a. 迷你電泳槽及鑄膠器

b. 抽氣櫃

6.藥品及試劑：

a. 中性清潔劑

b. 3% H₂O₂

c. dH₂O/DEPC

7.方法步驟：

１）以中性清潔劑仔細清洗電泳槽，並稍加晾乾。（注意：務必戴手套）

２）以3% H₂O₂注滿電泳槽，放置於室溫10分鐘。

３）倒去H₂O₂。

４）以dH₂O/DEPC徹底地沖洗電泳槽。

8.甲醛是一種常用的RNA變性劑，RNA首先以甲醛及formamide進行變性處理，以確保其二度結構完全被打開。由於甲醛是一種致癌物質，配製膠體及進行電泳均應在抽氣櫃中小心操作，電泳時所使用的緩衝液為1 x MOPS。另外，含有甲醛的洋菜膠體比一般的滑溜，也比較容易破裂，在移動膠體時應特別留神。

9.由於rRNA佔細胞RNA總量之80~85%，以EtBr浸染後，呈現於膠體上的兩個顯著RNA亮帶，應該分別為large與small rRNA（28S與18S）。如果分離效果良好的話，還可見到比較小的5S RNA及tRNA也呈特定亮帶出現。散佈於18S rRNA附近，呈smear狀態的就是mRNAs，這是因為mRNA存在量不多，而且長度不一的緣故。

10.儀器用具：

a. 65℃恆溫箱

b. 桌上型離心機

c. 迷你電泳槽及鑄膠器

d. UV transilluminator

e. 拍立得相機或影像分析系統

11.藥品及試劑：

a. 自大腸桿菌抽取之RNA或/與胞外轉錄反應所製備之正股（sense）RNA。

b. 5 x formaldehyde gel-running buffer: 0.1 M MOPS, pH 7.0, 40 mM sodium acetate, 5 mM EDTA

c. formaldehyde gel-loading buffer: 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 50% glycerol, 1 mM EDTA

d. ethidium bromide (1 mg/ml in dH₂O/DEPC)

e. dH₂O/DEPC

f. agarose

12.方法步驟：

１）準備1.2%甲醛洋菜膠，秤取0.48 g agarose置於100 ml 錐形瓶內，加入25 ml dH₂O/DEPC。（注意！下列均應戴手套並在抽氣櫃中操作）

２）以微波爐加熱溶解之後，混合均勻，置於抽氣櫃中30分鐘。

３）在凝固前，加入8 ml 5 X formaldehyde gel-running buffer及7.2 ml甲醛，混合均勻，在抽氣櫃中倒入鑄膠器。

４）取出4支1.5 ml微量離心管，分別標示#1~#4，依序加入下列各項試劑（體積單位為ml）：

５）混合均勻後，置於65 ℃反應15分鐘。

６）置於冰浴中，各管分別加入2 m l formaldehyde gel-loading buffer與1 ml ethidium bromide。

７）把凝固之洋菜膠放入電泳槽，加入1 x formaldehyde gel-running buffer，以50 V定電壓預跑5分鐘。

８）依序加入RNA樣品，以50 V定電壓跑，待BPB染劑移動至膠體2/3處時，關閉電源，將膠體移至UV transilluminator box上觀察RNA亮帶存在的情形，並拍照存證。

V.以毛細管轉移方式進行北方墨漬法

1.要進行北方雜合反應前，必須先將RNA自洋菜膠體中移至硝化纖維膜（nitrocellulose membrane）或尼龍膜（nylon membrane）上，此一過程為轉漬（blotting）（參見實驗8）。

2.儀器用具：

a. 玻璃轉漬槽

b. 玻璃平台

c. 塑膠盒

3.藥品及試劑：

a. 20x SSC: 0.3 M sodium citrate, pH 7.0, 3 M NaCl

b. nylon membrane

c. Whatman 3MM 濾紙

d. Parpfilm

e. 紙巾（吸水紙）

f. dH₂O/DEPC

4.方法步驟：

１）將甲醛洋菜膠放在塑膠盒內，以dH₂O/DEPC沖洗數次。（注意！務必戴手套，並留心不要把膠體弄破）

２）加入100ml 20x SSC，靜置5分鐘。

３）以毛細管轉移方式將RNA轉漬於尼龍膜上，如圖裝置並參考實驗8。

Ⅵ.北方雜合反應

1.儀器用具：

a. 塑膠盒

b. 平端鑷子

c. 封口機

d. 42 ℃, 50 ℃水槽

2.藥品及試劑：

a. 6 x SSC

b. nylon membrane

c. Hybridization solution: 50% foramide, 5 X SSC, 2% blocking reagent, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS

d. Whatman 3MM paper

e. 2 x SSC含0.1% SDS

f. 0.1x SSC含0.1% SDS

3.方法步驟：

１）拿掉膜上之物，並在膜上畫記槽（well）的位置及標定方向（或截角）。

２）將膜浸入20 ml 6 x SSC中5分鐘。

３）取出膜，置於衛生紙上風乾至少30分鐘。（與膠體接觸之面朝上）

４）將膜放入塑膠袋中，加入10 ml hybridization buffer，除去氣泡並封口，移至42 ℃水槽中反應1~2小時。

５）剪去一角，加入稀釋過之探針，重複前項封口，移至42℃水槽中過夜。

６）取出尼龍膜，放進80 ml 2 x SSC含0.1% SDS，於室溫漂洗二次，每次5分鐘。

７）接著以100 ml 0.1 x SSC含0.1% SDS在50 ℃下漂洗二次，每次15分鐘。

８）進行呈色反應（參見實驗9）。

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